《Bioact. Mater.》：支(zhi)架孔隙形(xing)態(tai)調(tiao)節骨(gu)再(zai)生(sheng)機制

骨(gu)仿(fang)生學(xue)和(he)結(jie)構工程(cheng)激(ji)發(fa)了人們(men)對(dui)優(you)化人工支架以(yi)實現更好(hao)的骨(gu)再(zai)生(sheng)的廣泛(fan)興(xing)趣。然而，支架孔隙形(xing)態(tai)調(tiao)節骨(gu)再(zai)生(sheng)背後的機制(zhi)尚不(bu)清楚(chu)，這(zhe)使(shi)得用於骨(gu)修復的支架(jia)結(jie)構(gou)設(she)計(ji)具(ju)有(you)挑戰性。為(wei)了解(jie)決這(zhe)個問題，來自(zi)華(hua)南理(li)工大學的況宇(yu)迪(di)、趙(zhao)娜如(ru)、王迎(ying)軍(jun)等(deng)人仔細評(ping)估(gu)了三(san)種(zhong)代表(biao)性孔(kong)隙形(xing)態(tai)（即圓(yuan)柱形（C）、螺(luo)旋形（G）和(he)菱形(xing)（D））β-TCP支(zhi)架(jia)的成(cheng)骨(gu)性能（圖1a）。結(jie)果表(biao)明 D 型支架(jia)通過(guo)增強(qiang) RhoA/ROCK2 通路的機械(xie)信(xin)號轉(zhuan)導(dao)促進(jin) BM

SC 向成(cheng)骨(gu)分(fen)化並(bing)分(fen)泌更多與遷移相(xiang)關(guan)的生長(chang)因子，從而在(zai)這(zhe)些支架(jia)中(zhong)實現最佳(jia)骨(gu)再(zai)生(sheng)（圖1b）。這(zhe)項工作(zuo)為開(kai)發(fa)新型生物適應(ying)性支(zhi)架設(she)計(ji)提(ti)供了對(dui)孔(kong)隙形(xing)態(tai)介(jie)導(dao)的骨(gu)再(zai)生(sheng)機制的見解(jie)。相(xiang)關(guan)研究成(cheng)果以“3D printed pore morphology mediates bone marrow stem cell behaviors via RhoA/ROCK2 signaling pathway for accelerating bone regeneration"為(wei)題於2026年01月(yue)10日(ri)發(fa)表(biao)在(zai)《Bioact. Mater.》上(shang)。

圖(tu)1 不(bu)同孔隙形(xing)態(tai)的支架(jia)方(fang)案(an)及(ji)支架(jia)-BMSC相(xiang)互作(zuo)用機(ji)制：（A）具有(you)圓(yuan)柱(zhu)形、螺旋形和(he)菱形(xing)孔(kong)形(xing)態(tai)的 3D 打印(yin)支架；（B）孔隙形(xing)態(tai)介(jie)導(dao)的細胞(bao)骨(gu)架力和(he) BMSCs 的核變(bian)形(xing)通過(guo) RhoA/ROCK2 信號通路促進(jin)骨(gu)再(zai)生(sheng)

1. 不(bu)同孔形(xing)態(tai)的β-TCP支架(jia)上(shang)的骨(gu)髓間充質(zhi)幹細胞(bao)行為

成(cheng)功制備(bei)了三種(zhong)孔結(jie)構(gou)的β-TCP支架(jia)（圖(tu)2a），BMSCs在(zai)支架(jia)上表(biao)現出不(bu)同的鋪(pu)展(zhan)狀(zhuang)態(tai)(圖2b)。由於細胞(bao)的不(bu)同伸展(zhan)和(he)伸(shen)長(chang)狀(zhuang)態(tai)會(hui)影響基(ji)因的表(biao)達，這(zhe)些支架(jia)上(shang)的BMSCs可(ke)能會(hui)表(biao)現出不(bu)同的細胞(bao)行為和命(ming)運。隨(sui)後制備(bei)了壹種(zhong)定制的具有(you)整(zheng)合(he)路徑(jing)的支架(jia)（每個(ge)路徑(jing)由壹種(zhong)孔形(xing)態(tai)組成(cheng)）評估(gu)BMSCs從支(zhi)架外到支架內(nei)部的遷移行為，如圖2C所(suo)示。遷移實驗表(biao)明，D-和G-支(zhi)架具有(you)更(geng)好(hao)的引(yin)導(dao)骨(gu)再(zai)生(sheng)的潛力(li)（圖(tu)2D，E）。CCK8檢(jian)測(ce)結果顯(xian)示，BMSCs在(zai)C-支(zhi)架(jia)上的增殖(zhi)情(qing)況明顯好(hao)於其他各(ge)組(圖(tu)2F)，這(zhe)可(ke)能歸因於類(lei)多(duo)邊形展(zhan)開(kai)態(tai)引(yin)起(qi)的內(nei)應力的松弛(chi)堿性磷(lin)酸酶(mei)（ALP）活(huo)性（圖(tu)2G）和RT-qPCR（圖(tu)2H）結(jie)果(guo)顯(xian)示，第(di)7天，D支架(jia)組ALP、Col-1、OCN和(he)Runx2的表(biao)達最高，C支(zhi)架組最(zui)。低。上(shang)述結果證實了(le)D-支架(jia)在(zai)這(zhe)些支架(jia)中(zhong)誘導BMSCs成(cheng)骨(gu)分(fen)化效(xiao)。果(guo)。最。好。此外(wai)，研(yan)究了孔形(xing)態(tai)對(dui)BMSCs血(xue)管生成(cheng)因子旁(pang)分(fen)泌的影響（圖(tu)2I）)。成(cheng)血管測試表(biao)明G-支架(jia)組BMSC培(pei)養上清液(ye)中(zhong)VEGF和(he)Ang-1的濃(nong)度(du)最(zui)高（圖(tu)2J），具有(you)更好(hao)的骨(gu)再(zai)生(sheng)效(xiao)果(guo)（圖2K,L）。

圖2 骨(gu)髓間充質(zhi)幹細胞(bao)在(zai)不(bu)同β-tCP支架(jia)上(shang)的細胞(bao)行為

2. 孔形態(tai)介(jie)導(dao)的骨(gu)髓間充質(zhi)幹細胞(bao)行為的信號轉(zhuan)導(dao)機制(zhi)

RNA測(ce)序(xu)結果(guo)顯(xian)示，與(yu)C組相(xiang)比，D組和(he)G組的壹些(xie)基(ji)因表(biao)達上調(tiao)（圖3A），表(biao)明骨(gu)髓間充質(zhi)幹細胞(bao)在(zai)D-支(zhi)架(jia)中的遷移能力最(zui)。強。此外(wai)，與(yu)C-支架(jia)組相(xiang)比，G-和D-支(zhi)架(jia)組中(zhong)成(cheng)骨(gu)分(fen)化相(xiang)關(guan)基(ji)因(例如(ru)OCN3、BMP2和(he)ALPK1)和血管生成(cheng)相(xiang)關(guan)因子(例如VEGFA、PDGFC和(he)PDGFA)也上調(tiao)(圖3B，C)。聚(ju)類(lei)分(fen)析(xi)和(he)熱圖的樹(shu)狀(zhuang)圖(tu)顯(xian)示，RhoA/ROCK2信(xin)號通路相(xiang)關(guan)基(ji)因(DVL2、DAAM1、RhoA和ROCK2)在(zai)G-和(he)D-支架組的表(biao)達高於C-支架組(圖(tu)3D)。RT-qPCR分(fen)析(xi)和(he)Western blotting也證實了(le)RhoA/ROCK2信號通路相(xiang)關(guan)基(ji)因和蛋(dan)白在(zai)G-支(zhi)架和(he)D-支架中的高表(biao)達(圖3E-L)。這(zhe)些結果(guo)揭(jie)示了(le)BMSCs在(zai)不(bu)同孔形(xing)態(tai)的支架(jia)中(zhong)進(jin)行不(bu)同的細胞(bao)骨(gu)架重組和(he)機械(xie)應力傳遞。

圖(tu)3 RNA測序(xu)和生(sheng)物信(xin)息(xi)學(xue)分(fen)析(xi)

隨(sui)後，檢(jian)測(ce)了在不(bu)同支架(jia)上(shang)培(pei)養的BMSCs在含(han)有(you)和(he)不(bu)含(han)RhoA/ROCK2抑制劑的培(pei)養液(ye)中(zhong)的成(cheng)骨(gu)分(fen)化和(he)遷移因子水平。當(dang)細胞(bao)培(pei)養液(ye)中(zhong)沒(mei)有(you)RhoA/ROCK2抑制劑時，G-和(he)D-支架(jia)組比(bi)C-支架(jia)組RhoA、ROCK2和(he)激(ji)活(huo)蛋(dan)白(p-RhoA、p-ROCK2)水平更(geng)高(圖(tu)4A-D)。CDC42、OCN和Runx2的蛋白表(biao)達水平順(shun)序(xu)為D-支(zhi)架(jia)>G-支(zhi)架>C-支架(jia)。這(zhe)些結果(guo)表(biao)明，RhoA/ROCK2信號通路在轉(zhuan)導(dao)支架(jia)孔(kong)形(xing)態(tai)刺激(ji)調(tiao)控BMSCs成(cheng)骨(gu)分(fen)化和(he)遷移中發(fa)揮了重要作(zuo)用。圖(tu)4E是支架(jia)孔(kong)形(xing)態(tai)介(jie)導(dao)的BMSC行為機理圖(tu)，孔形(xing)態(tai)通過(guo)RhoA/ROCK2信號通路影響BMSCs成(cheng)骨(gu)分(fen)化和(he)遷移。

圖4 (A-C)藥(yao)物對(dui)RhoA/ROCK2信(xin)號通路的幹預；(D)用ELISA法檢(jian)測(ce)在RhoA和RoCK2抑制劑幹預前(qian)後7天不(bu)同孔隙形(xing)態(tai)的成(cheng)骨(gu)相(xiang)關(guan)Runx2和遷移相(xiang)關(guan)CDC42蛋白的水平；(E)機(ji)制(zhi)綜述(shu)：孔(kong)形態(tai)通過(guo)RhoA/ROCK2信號通路影響BMSCs成(cheng)骨(gu)分(fen)化和(he)遷移

3. 不(bu)同孔形(xing)態(tai)支架(jia)體內(nei)骨(gu)再(zai)生(sheng)的評價(jia)

隨(sui)後，構建(jian)股骨(gu)髁缺損(sun)評(ping)價(jia)支(zhi)架體內(nei)骨(gu)再(zai)生(sheng)效(xiao)果(guo)（圖5A）。骨(gu)小梁計數、Micro-CT、血管分(fen)布檢(jian)測(ce)、Van Gieson染色(se)(VG)結果(guo)均顯(xian)示G-和(he)D-支(zhi)架(jia)的血管生成(cheng)能力強(qiang)於C-支架，可(ke)以促(cu)進(jin)骨(gu)再(zai)生(sheng)。

圖5 股骨(gu)髁缺損(sun)區(qu)術(shu)後4周、8周(zhou)、12周植(zhi)入支架(jia)的組織學(xue)分(fen)析(xi)及(ji)Micro-CT檢(jian)查(zha)

此外，通過(guo)連續熒光標(biao)記(ji)檢(jian)測(ce)所有支(zhi)架(jia)在2-4周和6-8周的動態(tai)成(cheng)骨(gu)來評估(gu)骨(gu)再(zai)生(sheng)率(圖6)。柱(zhu)狀(zhuang)缺損(sun)區(qu)被(bei)分(fen)為三個部分(fen)(外層(ceng)：0-1 mm，中層(ceng)：1-2 mm，內(nei)層(ceng)：2-3 mm)，以更好地定量(liang)缺損(sun)區(qu)不(bu)同區(qu)域的新骨(gu)生長(chang)(圖(tu)6a)。熒光標(biao)記(ji)染色(se)結果(guo)顯示，C-支(zhi)架(jia)組支(zhi)架的新骨(gu)沈積(ji)速度(du)從(cong)外(wai)到(dao)中逐漸減(jian)慢(man)，C-支(zhi)架(jia)中(zhong)心(xin)區(qu)域幾(ji)乎沒有(you)新骨(gu)(圖6B，C)。相(xiang)比之下(xia)，D和(he)G支架的中層(ceng)和中心層(ceng)的骨(gu)沈積(ji)速率(lv)明顯較高，表(biao)明細胞(bao)在(zai)支(zhi)架(jia)中的遷移速率不(bu)同。這(zhe)些結果(guo)揭(jie)示了(le)支(zhi)架(jia)形態(tai)對(dui)體(ti)內(nei)新骨(gu)生長(chang)的重要指導作(zuo)用。

圖(tu)6 成(cheng)骨(gu)的動態(tai)組織學(xue)分(fen)析(xi)

綜上(shang)所(suo)述，本文在(zai)體(ti)外(wai)和體內(nei)評估(gu)了三(san)種(zhong)孔結(jie)構(gou)的β-TcP支架(jia)的成(cheng)骨(gu)潛力。D-支(zhi)架(jia)通過(guo)影響BMSCs的黏(nian)附(fu)狀(zhuang)態(tai)，激(ji)活(huo)較高水平的RhoA/ROCK2信號轉(zhuan)導(dao)通路，促進(jin)細胞(bao)遷移，促進(jin)BMSCs的成(cheng)骨(gu)分(fen)化。同(tong)時，D-支(zhi)架和(he)G-支(zhi)架(jia)還可(ke)通過(guo)影響骨(gu)髓間充質(zhi)幹細胞(bao)的旁(pang)分(fen)泌來促進(jin)血管生成(cheng)。在體內(nei)骨(gu)修復的評價(jia)中(zhong)，D-支(zhi)架在(zai)促進(jin)骨(gu)修復方(fang)面(mian)的表(biao)現優(you)於G-支架和C-支(zhi)架(jia)。這(zhe)項工作(zuo)加深(shen)了(le)我(wo)們(men)對(dui)孔(kong)形(xing)態(tai)影響細胞(bao)行為的機制(zhi)的理解(jie)。