蘭(lan)州(zhou)大學(xue)範增(zeng)傑(jie)：協同緩(huan)解(jie)肌肉(rou)力量減退(tui)促進神經再生的仿(fang)生海參(can)微針(zhen)神經導管(guan)

周(zhou)圍(wei)神經損傷(shang)（Peripheral nerve injury，PNI）是(shi)壹(yi)種常見(jian)的外傷(shang)性疾(ji)病(bing)，常由車禍、戰(zhan)傷(shang)、工(gong)傷(shang)和(he)醫(yi)療事(shi)故(gu)等引起。PNI的(de)典(dian)型(xing)臨(lin)床表(biao)現(xian)為受損神經所(suo)支配(pei)的(de)區(qu)域出(chu)現感覺和(he)運(yun)動(dong)功能(neng)障礙，其嚴重程(cheng)度因損傷(shang)程(cheng)度而異。這(zhe)種疾(ji)病(bing)給患(huan)者帶來(lai)了極(ji)大(da)的(de)痛苦(ku)與(yu)不便，嚴重影響了他們(men)的(de)生活質(zhi)量(liang)；同時，也(ye)給患(huan)者與(yu)社會(hui)帶來(lai)了沈重的(de)經濟(ji)負(fu)擔。

PNI的傳(chuan)統(tong)治療方(fang)法可分(fen)為手術(shu)治療和(he)非手術(shu)治療兩(liang)類(lei)。非(fei)手術(shu)治療方(fang)法包(bao)括電刺激、磁刺激、激光光(guang)療等(deng)，而手術(shu)治療方(fang)法包(bao)括神經縫(feng)合(he)術(shu)和神經移植(zhi)術(shu)（包括同(tong)種異體(ti)移(yi)植(zhi)和自(zi)體移(yi)植(zhi)）。其中，自體移(yi)植(zhi)術(shu)因其療效(xiao)最(zui)佳，被認(ren)為是(shi)PNI治(zhi)療的(de)“金標(biao)準(zhun)"。然(ran)而，目前的PNI傳(chuan)統治(zhi)療方(fang)法仍(reng)然(ran)存在(zai)較大(da)的局限(xian)性，主要體(ti)現在(zai)以(yi)下兩(liang)個(ge)方(fang)面：自體移植(zhi)術(shu)所(suo)需的(de)供(gong)體神經來源有限(xian)，且術(shu)後存在(zai)潛(qian)在(zai)的(de)致(zhi)畸、致(zhi)癌(ai)性等(deng)風險；此(ci)外，PNI並發(fa)的(de)肌肉(rou)力量減退(tui)問題(ti)也(ye)會進(jin)壹(yi)步影響功能(neng)恢(hui)復的效(xiao)果(guo)。

針對(dui)以(yi)上兩(liang)方(fang)面，蘭(lan)州(zhou)大學(xue)口腔醫(yi)學(xue)院(yuan)範增(zeng)傑(jie)教(jiao)授(shou)團隊設(she)計開發了(le)壹(yi)種具(ju)有海參(can)仿(fang)生特(te)性的(de)微針神經導管(guan)（MNGCs），用於PNI及其導致的肌(ji)肉(rou)力量減退(tui)的協同高效(xiao)治療。該(gai)MNGCs是由摩(mo)方(fang)精密(mi) microArch®S230 （精度：2μm）高精度3D打印設(she)備加工(gong)模具(ju)後經PDMS翻模制備而(er)成(cheng)。相(xiang)關研究成(cheng)果(guo)以“Sea Cucumber-Inspired Microneedle Nerve Guidance Conduit for Synergistically Inhibiting Muscle Atrophy and Promoting Nerve Regeneration"為題(ti)發(fa)表(biao)在(zai)國(guo)際(ji)學(xue)術(shu)期刊(kan)《ACS Nano》上。蘭(lan)州(zhou)大學(xue)口腔醫(yi)學(xue)院(yuan)碩(shuo)士(shi)研究生(sheng)胡策(ce)文(wen)、劉(liu)斌為共(gong)同(tong)第壹(yi)作(zuo)者，蘭(lan)州(zhou)大學(xue)口腔醫(yi)學(xue)院(yuan)範增(zeng)傑(jie)教(jiao)授(shou)和(he)康(kang)涅(nie)狄(di)格大學(xue)化學(xue)與(yu)生物(wu)分(fen)子(zi)工(gong)程(cheng)系孫陸(lu)逸(yi)教(jiao)授(shou)為共(gong)同(tong)通(tong)訊(xun)作(zuo)者。

海參(can)是壹(yi)種海生軟(ruan)體(ti)動(dong)物(wu)，體(ti)型(xing)呈圓筒(tong)狀，體表(biao)外側(ce)長有(you)規(gui)則排列(lie)的(de)錐形(xing)狀疣(you)足，內(nei)側則長有(you)規(gui)則排列(lie)的(de)條(tiao)狀肌肉(rou)。海參(can)的體(ti)壁柔(rou)軟(ruan)，含(han)有(you)大量的膠(jiao)原。膠(jiao)原因具(ju)有不對稱的晶(jing)體(ti)結構(gou)，具(ju)有壓(ya)電效(xiao)應。受此(ci)啟(qi)發(fa)，作(zuo)者根(gen)據海參(can)的生(sheng)理(li)特(te)性和(he)解(jie)剖特(te)征設(she)計了MNGCs。

MNGC由聚(ju)己內(nei)酯(zhi)（PCL），還(hai)原氧化石(shi)墨烯（rGO）和納米(mi)氧化(hua)鋅顆粒(li)（ZnO NPs）組(zu)成(cheng)。其中，PCL為MNGCs的(de)基質(zhi)材料(liao)，使MNGCs具(ju)有良(liang)好(hao)的柔(rou)韌性與(yu)生物(wu)相(xiang)容(rong)性；rGO和(he)ZnO NPs分(fen)別賦予了MNGCs良(liang)好(hao)的導(dao)電性能(neng)與(yu)壓電性能(neng)，使(shi)MNGCs能(neng)產(chan)生並傳(chuan)導(dao)適宜(yi)的(de)電刺激（ES）。這是(shi)模仿(fang)了海參(can)具(ju)有產(chan)生(sheng)並傳(chuan)導(dao)生物(wu)電的(de)潛(qian)力(li)的(de)生(sheng)理(li)特(te)性。同(tong)時，MNGCs的外側(ce)為微(wei)針(zhen)（MNs）的(de)針尖，內側(ce)為微(wei)通(tong)道；MNs可以(yi)刺入神經周(zhou)圍(wei)肌(ji)肉(rou)並傳(chuan)導(dao)ES，而微(wei)通(tong)道可以(yi)引(yin)導(dao)雪(xue)旺(wang)細(xi)胞（SCs）定(ding)向(xiang)生(sheng)長。這(zhe)是(shi)模仿(fang)了海參(can)具(ju)有錐(zhui)形(xing)疣(you)足和(he)條(tiao)帶(dai)肌肉(rou)的解(jie)剖特(te)征。MNGCs植(zhi)入體(ti)內後(hou)，因形(xing)變而實(shi)現力(li)電轉(zhuan)換(huan)產(chan)生ES。在MNGCs的內(nei)側(ce)，ES與(yu)微通(tong)道共同(tong)使SCs定(ding)向(xiang)高效(xiao)遷移(yi)，促進軸(zhou)突和(he)髓(sui)鞘的新(xin)生進而(er)促進神經的新(xin)生；同時(shi)，在(zai)MNGCs的(de)外側(ce)，ES通(tong)過(guo)MNs向(xiang)其插入的肌(ji)肉(rou)中傳導(dao)ES，進而(er)抑制肌肉(rou)力量減退(tui)。最(zui)終實(shi)現了(le)PNI及其導致的肌(ji)肉(rou)力量減退(tui)的高效(xiao)協同治(zhi)療。

首(shou)先(xian)制備了(le)具(ju)有良(liang)好(hao)導電性能(neng)和(he)壓電性能(neng)的(de)復合(he)材料(liao)PG與(yu)PZG。MNGCs的基質(zhi)材料(liao)——PCL原本(ben)是(shi)不具(ju)有導(dao)電性能(neng)和(he)壓電性能(neng)的(de)材料(liao)，向其中添加了(le)rGO（PG）和(he)rGO+ZnO NPs（PZG）後(hou)，復(fu)合(he)材料(liao)的導(dao)電性能(neng)明顯(xian)提升，也(ye)具(ju)有了(le)壓(ya)電性能(neng)。當(dang)rGO含(han)量(liang)為2%時(shi)，其電導(dao)率(lv)為1.03*10-3S/cm；而(er)當(dang)ZnO NPs含(han)量(liang)為2%時(shi)，其可輸(shu)出(chu)的電壓(ya)和電流(liu)的最(zui)大(da)值分(fen)別為4.6 V和(he)1.9 μA。這(zhe)壹(yi)優良(liang)的電學(xue)特(te)性具(ju)有充(chong)足(zu)的潛(qian)力(li)促進PNI及肌肉(rou)力量減退(tui)的協同治(zhi)療。又(you)因為rGO和(he)ZnO NPs具(ju)有潛(qian)在(zai)的(de)生(sheng)物(wu)毒(du)性，通(tong)過(guo)MTT法(fa)對(dui)其在PCL中的含(han)量(liang)進行了(le)篩(shai)選，發現(xian)當(dang)rGO和(he)ZnO NPs的(de)含(han)量(liang)≤2%，材料(liao)仍具(ju)有良(liang)好(hao)的生(sheng)物(wu)相(xiang)容(rong)性（見(jian)圖3-A&B）。因此(ci)，確(que)定(ding)PG與(yu)PZG中 rGO和(he)ZnO NPs的含(han)量(liang)為2%，並進(jin)行後(hou)續實(shi)驗。

研究團隊使用上述(shu)PCL，PG與(yu)PZG作(zuo)為材料(liao)，通(tong)過(guo)模板(ban)法(fa)制備了(le)MNGCs。如(ru)圖(tu)三所(suo)示(shi)，藍色(se)的模板(ban)為制備MNs用的PDMS陰(yin)模。此(ci)PDMS陰模的(de)制備過(guo)程(cheng)如(ru)下：先(xian)使(shi)用摩方(fang)精密(mi)microArch®S230 3D打(da)印設(she)備構(gou)建主MNs，再使(shi)用PDMS轉寫主MNs以獲(huo)得PDMS陰(yin)模。材料(liao)註入(ru)PDMS陰模後(hou)，使(shi)用摩方(fang)精密(mi)microArch®S230 3D打(da)印設(she)備構(gou)建的黃(huang)色(se)模板(ban)——塑(su)料(liao)微通(tong)道模板(ban)，此(ci)微通(tong)道模板(ban)是(shi)直接由設(she)備構(gou)建而來(lai)。MNs基底背(bei)側的(de)微通(tong)道構(gou)建完畢且MNs冷卻(que)後，將(jiang)其取出(chu)並卷(juan)成(cheng)管(guan)狀，即可獲(huo)得(de)MNGCs。

隨(sui)後(hou)對MNGCs進(jin)行了(le)理(li)化(hua)組(zu)成(cheng)、宏微(wei)觀形(xing)貌與(yu)力學(xue)性能(neng)的(de)分(fen)析(xi)。FTIR，XRD首(shou)先(xian)證明了(le)MNGCs中含(han)有(you)PCL和ZnO NPs，Raman不僅(jin)證明了(le)MNGCs中含(han)有(you)rGO，且此(ci)rGO是被成功還(hai)原的。PCL在添加了(le)rGO和(he)ZnO NPs後(hou)，由疏水(shui)轉變為親(qin)水(shui)，且親(qin)水(shui)性較(jiao)優秀，這有(you)利(li)於其生物(wu)應用。SEM證明了(le)MNGCs中的MNs和(he)微(wei)通(tong)道具(ju)有良(liang)好(hao)的微(wei)觀形(xing)貌，而MNGCs的(de)宏觀(guan)形(xing)貌也(ye)與(yu)海參(can)高度相(xiang)似。MNGCs的導管(guan)主體部(bu)分(fen)均(jun)具(ju)有較(jiao)好(hao)的拉(la)伸性能(neng)，能(neng)夠(gou)穩(wen)定(ding)橋接神經而不斷(duan)裂；由PG和(he)PZG制成的(de)MNGCs的MNs針(zhen)尖部分(fen)也(ye)具(ju)有較(jiao)好(hao)的壓(ya)縮(suo)性能(neng)，能(neng)夠(gou)刺穿並插入肌肉(rou)中，為ES的(de)高效(xiao)傳遞(di)創造(zao)條(tiao)件(jian)。

圖四. MNGCs的(de)表(biao)征。(A). MNGCs的FTIR圖譜。(B). MNGCs的(de)XRD圖(tu)譜(pu)。(C). MNGCs的Raman圖(tu)譜。(D)和(he)(E). 不同MNGCs的水(shui)接觸角(jiao)照片及其定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)。(F)和(he)(G). MNGCs的MNs與(yu)微通(tong)道的SEM照片及其EDS分(fen)析(xi)。(H).MNGCs的(de)數(shu)碼(ma)照片。(I)和(he)(J).MNGCs的導(dao)管(guan)本(ben)體(ti)的拉伸試驗的應力(li)-應變曲(qu)線(xian)及其楊(yang)氏(shi)模量(liang)。(K)和(he)(I). MNGCs的MNs的(de)壓縮(suo)試驗的試驗力-位移曲(qu)線(xian)及其位移量為0.75mm時(shi)的(de)試驗力。

在體外層面對MNGCs促進PNI修復(fu)的效(xiao)果(guo)進行了(le)驗證，研究團隊發現(xian)微(wei)通(tong)道能(neng)通(tong)過(guo)限(xian)定(ding)SCs的(de)分(fen)布(bu)來(lai)引(yin)導(dao)其定(ding)向(xiang)生(sheng)長增(zeng)殖(zhi)，而ES的(de)促進作(zuo)用和導(dao)電微(wei)環(huan)境的(de)改善均(jun)有利(li)於提升SCs的線性遷(qian)移速率(lv)，其中ES的促進作(zuo)用更為明顯(xian)。上述(shu)兩(liang)方(fang)面的共同作(zuo)用使得(de)SCs能(neng)在(zai)MNGCs內部高效(xiao)定(ding)向(xiang)遷(qian)移(yi)，進(jin)而促進PNI的(de)修復(fu)。

研究團隊建立了大鼠的(de)坐(zuo)骨神經大範圍(wei)損(sun)傷(shang)模型(xing)，在(zai)體內(nei)層面對MNGCs協同緩(huan)解(jie)肌肉(rou)力量減退(tui)和促進神經再生的效(xiao)果(guo)進行了(le)研究。首(shou)先(xian)研究了(le)MNGCs緩(huan)解(jie)肌肉(rou)力量減退(tui)的效(xiao)果(guo)。對腓(fei)腸(chang)肌(ji)健側/患(huan)側進行了(le)對(dui)比，發現PZG-MNGCs組(zu)的(de)腓(fei)腸(chang)肌力量減退(tui)程(cheng)度，不論是大(da)體(ti)觀察(cha)狀態還(hai)是(shi)濕重比(bi)均(jun)接近自(zi)體移(yi)植(zhi)治療的(de)效(xiao)果(guo)。Masson染色(se)的(de)結(jie)果(guo)，即PZG-MNGCs組(zu)的(de)腓(fei)腸(chang)肌的肌纖(xian)維(wei)面積最(zui)高且膠(jiao)原纖(xian)維(wei)面積較(jiao)低(di)，也(ye)印證了這(zhe)壹(yi)結論。因此(ci)可以(yi)確(que)定(ding)，PZG-MNGCs緩(huan)解(jie)PNI導致(zhi)的肌肉(rou)力量減退(tui)的效(xiao)果(guo)優異。

隨(sui)後(hou)研究了(le)MNGCs促進神經再生的效(xiao)果(guo)。通(tong)過(guo)對(dui)新(xin)生神經進行甲苯(ben)胺(an)藍(lan)（新(xin)生軸突）和(he)勒(le)克索固藍(lan)（新(xin)生髓鞘(qiao)）和(he)CD31-IHC（新(xin)生微血(xue)管(guan)）染色(se)，發(fa)現(xian)PZG-MNGCs組(zu)的(de)神經再生水(shui)平接近自(zi)體移(yi)植(zhi)治療組(zu)。

最(zui)後(hou)研究了(le)MNGCs促進神經再生的潛(qian)在(zai)機(ji)制。將(jiang)NF-200（軸(zhou)突）和(he)S-100β（髓(sui)鞘）作(zuo)為標(biao)記(ji)為進(jin)行IF染色(se)，發(fa)現(xian)PZG-MNGCs組(zu)中(zhong)NF-200和(he)S-100β的(de)表(biao)達水(shui)平接近自(zi)體移(yi)植(zhi)治療組(zu)。這(zhe)說明PZG-MNGCs主要依(yi)靠施(shi)加ES+改善導電微(wei)環(huan)境來(lai)促進軸(zhou)突和(he)髓(sui)鞘的再生，進而(er)促進神經的再生。

綜上所(suo)述(shu)，具(ju)有海參(can)仿(fang)生特(te)性的(de)PZG-MNGCs能(neng)高效(xiao)產生(sheng)並傳(chuan)導(dao)壓電ES，在(zai)確(que)保(bao)穩(wen)定(ding)橋接缺損神經和可以(yi)向(xiang)肌(ji)肉(rou)傳遞ES的(de)前提下，通(tong)過(guo)內(nei)側(ce)的(de)微(wei)通(tong)道共同(tong)促進SCs遷(qian)移以(yi)促進神經再生，同時(shi)將(jiang)ES通(tong)過(guo)MNs傳(chuan)遞(di)至(zhi)周(zhou)圍(wei)肌(ji)肉(rou)，最(zui)終在協同緩(huan)解(jie)肌肉(rou)力量減退(tui)和促進神經再生中取(qu)得(de)了(le)相(xiang)當(dang)接近自(zi)體移(yi)植(zhi)治療這(zhe)壹(yi)“金標(biao)準(zhun)"的(de)治(zhi)療效(xiao)果(guo)。