3D打(da)印(yin)血(xue)管化(hua)類器(qi)官(guan)芯(xin)片，成(cheng)功解決(jue)類器(qi)官(guan)“長(chang)不大”的(de)難題！

類器(qi)官(guan)是(shi)壹(yi)種能夠(gou)復現(xian)特定器(qi)官(guan)結構與(yu)固(gu)有功能的(de)三維(wei)（3D）細胞培(pei)養模型(xing)。然(ran)而(er)，現(xian)有類器(qi)官(guan)技術存在關鍵缺(que)陷——缺(que)乏(fa)復雜(za)血(xue)管網(wang)絡，導致氧(yang)氣(qi)及(ji)必(bi)需營養物質的(de)輸(shu)送(song)受(shou)限。結合其固有的(de)尺寸(cun)限制(zhi)與(yu)代(dai)謝物累積(ji)問題，類器(qi)官(guan)難以模擬真(zhen)實器(qi)官(guan)的(de)天然(ran)復雜(za)性(xing)，從而(er)限制(zhi)其實際應(ying)用價值。

為突破這(zhe)壹技術瓶頸，來(lai)自南(nan)昌(chang)大學(xue)第壹附(fu)屬醫(yi)院(yuan)、復旦(dan)大(da)學(xue)、摩方精(jing)密(mi)、昆明(ming)醫(yi)科(ke)大(da)學(xue)等聯合研(yan)究(jiu)團隊成(cheng)功開(kai)發出(chu)可培(pei)養厘米級腫瘤或(huo)器(qi)官(guan)源類器(qi)官(guan)的(de)新(xin)型(xing)培(pei)養平臺(tai)。該(gai)平臺(tai)通(tong)過摩方精(jing)密(mi)面(mian)投影(ying)微(wei)立體(ti)光刻(ke)（PμSL）技術3D打(da)印(yin)定(ding)制(zhi)化(hua)類器(qi)官(guan)芯(xin)片，其內部(bu)集成(cheng)微米(mi)級仿生(sheng)微血(xue)管網(wang)絡，並引入灌註(zhu)裝(zhuang)置(zhi)以模擬血(xue)流動力(li)學(xue)特征，在實現(xian)營養液(ye)持(chi)續供(gong)給與(yu)全浸沒培(pei)養的(de)同(tong)時，有效(xiao)克服了類器(qi)官(guan)因(yin)營養獲(huo)取(qu)不(bu)足(zu)導致的(de)尺寸(cun)受(shou)限難題。這(zhe)壹(yi)技術不(bu)僅使(shi)體(ti)外構(gou)建大(da)尺(chi)度(du)腫瘤及(ji)正常(chang)組(zu)織模型(xing)成(cheng)為可能，還(hai)為藥(yao)效(xiao)毒(du)理(li)評(ping)估(gu)與(yu)類器(qi)官(guan)標準化生(sheng)產提供(gong)了創新(xin)解決(jue)方案(an)。相關成(cheng)果以“Vascularized organoid-on-a-chip for centimeter-scale organoid cul-tivation"發表(biao)於著名(ming)期刊(kan)《Bio-Design and Manufacturing》上(shang)。

01 基於微納(na)3D打印(yin)的(de)微血(xue)管類器(qi)官(guan)芯(xin)片

為模擬生(sheng)理相(xiang)關性(xing)更強的(de)毛細血(xue)管網(wang)絡，類器(qi)官(guan)芯(xin)片采用中空(kong)管(guan)狀(zhuang)結構設(she)計(ji)，單管(guan)道(dao)內徑(jing)80μm、壁厚20μm，相鄰(lin)通(tong)道(dao)間距(ju)400μm。每根(gen)通(tong)道(dao)周(zhou)向均(jun)勻(yun)分(fen)布(bu)四(si)組(zu)寬(kuan)度(du)＜10μm的(de)狹(xia)縫(feng)，沿(yan)管(guan)道(dao)軸向以300μm為間(jian)隔(ge)周(zhou)期性(xing)排布(bu)。裝(zhuang)置(zhi)入口與(yu)出(chu)口(kou)直徑(jing)均(jun)為(wei)0.75mm，整體(ti)由(you)摩方精(jing)密(mi)microArch® S230 （精(jing)度(du)：2μm）超(chao)高(gao)精(jing)度(du)3D打(da)印(yin)系(xi)統(tong)搭(da)配(pei)摩方BIO樹脂(zhi)材(cai)料壹體化成(cheng)型(xing)制(zhi)備(bei)而(er)成(cheng)。

該(gai)裝(zhuang)置(zhi)通(tong)過中空(kong)管(guan)狀"人工(gong)血(xue)管"（圖(tu)1a）模擬血(xue)管結構主(zhu)體(ti)，其管壁設計(ji)7-10μm孔徑微(wei)孔以實現(xian)生(sheng)理級(ji)營養擴散（圖(tu)1b-c）。為精(jing)準(zhun)模擬交叉(cha)血(xue)管網(wang)絡拓撲，裝(zhuang)置(zhi)內集(ji)成(cheng)5層仿生(sheng)結構單元——每(mei)層(ceng)包(bao)含(han)14條平行"人工(gong)血(xue)管"及(ji)7條橫向支(zhi)撐(cheng)梁（圖(tu)1a-b）。生(sheng)物相(xiang)容性(xing)驗證(zheng)表(biao)明：BIO樹脂(zhi)浸提液(ye)共培(pei)養體系對(dui)類器(qi)官(guan)擴(kuo)增無不(bu)良影(ying)響(xiang)，且在濃度(du)梯度(du)測(ce)試(shi)中(zhong)，人源肺(fei)癌(ai)（腫瘤組(zu)織）、氣(qi)道(dao)與腎(shen)臟(zang)（正常(chang)組(zu)織）來(lai)源類器(qi)官(guan)的(de)活性(xing)均(jun)未(wei)出(chu)現(xian)顯著性(xing)抑制(zhi)。

02 肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)芯(xin)片模型(xing)的(de)建立(li)

首(shou)先(xian)，研(yan)究(jiu)團隊構建(jian)了肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)（圖(tu)2a），其傳(chuan)統(tong)培(pei)養7天後直徑(jing)停(ting)滯於約200μm（圖(tu)2b）。將(jiang)經(jing)消(xiao)化(hua)的(de)肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)懸(xuan)浮(fu)於基質膠(jiao)後接種(zhong)至(zhi)毛細血(xue)管芯(xin)片，成(cheng)功實現(xian)類器(qi)官(guan)片段移(yi)植(zhi)，並(bing)持(chi)續培(pei)養超過30天（圖(tu)2c）。基於該(gai)模型(xing)對(dui)腫瘤類器(qi)官(guan)長(chang)周(zhou)期、大(da)尺(chi)度(du)培(pei)養的(de)顯著支(zhi)持(chi)能力(li)及其特別生(sheng)長(chang)表(biao)型(xing)，將(jiang)其命名(ming)為"厘(li)米(mi)級腫瘤類器(qi)官(guan)"（圖(tu)2a,c）。Ki67免疫組(zu)化(hua)證(zheng)實肺(fei)癌(ai)厘米(mi)級類器(qi)官(guan)的(de)增殖活性(xing)顯著高於傳(chuan)統(tong)類器(qi)官(guan)（圖(tu)2d）。

免疫染(ran)色(se)驗證(zheng)厘米(mi)級(ji)類器(qi)官(guan)完(wan)整保留(liu)源腫瘤的(de)病理(li)學(xue)形態(tai)與分子特征（圖(tu)2e），甲狀腺(xian)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)1（TTF-1）及NapsinA抗體(ti)共(gong)染(ran)進壹步(bu)確(que)認(ren)其肺(fei)腺癌(ai)來(lai)源屬性(xing)（圖(tu)2f）。上(shang)述結果表(biao)明，在需要(yao)大(da)尺(chi)寸(cun)組(zu)織的(de)肺(fei)癌(ai)模型(xing)構(gou)建(jian)中(zhong)，厘米(mi)級(ji)類器(qi)官(guan)可作為(wei)傳(chuan)統(tong)類器(qi)官(guan)的(de)重要(yao)補(bu)充體系(xi)，且突破常(chang)規(gui)尺寸(cun)限制(zhi)實現(xian)了持(chi)續性(xing)生(sheng)長(chang)（圖(tu)2g）。在傳(chuan)統(tong)培(pei)養中，上(shang)皮源性(xing)肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)形成(cheng)囊狀結構，但(dan)因(yin)營養擴散限制(zhi)導致核(he)心區域細胞雕亡(wang)。而(er)芯(xin)片培(pei)養體系呈現(xian)三階(jie)段生(sheng)長(chang)特征：早(zao)期形成(cheng)球狀(zhuang)克隆並逐步(bu)擴(kuo)增；中期持(chi)續生(sheng)長(chang)且無結構崩(beng)解；培(pei)養12天後類器(qi)官(guan)間(jian)建(jian)立緊密(mi)連接(jie)，形成(cheng)與含(han)血(xue)管網(wang)絡的(de)體內腫瘤高(gao)度(du)相(xiang)似(si)的(de)整合(he)結構（圖(tu)2g-h）。

03 肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)對(dui)順(shun)鉑的(de)敏感(gan)性(xing)顯著增強

順(shun)鉑作為(wei)不(bu)可切除性(xing)非小(xiao)細胞肺(fei)癌(ai)（NSCLC）的(de)標準化療(liao)藥(yao)物，亦廣(guang)泛(fan)用於小(xiao)細胞肺(fei)癌(ai)的(de)治療(liao)。為(wei)評(ping)估(gu)厘(li)米級腫瘤類器(qi)官(guan)對(dui)抗癌(ai)藥(yao)物的(de)反(fan)應(ying)特性(xing)，本(ben)研(yan)究(jiu)首(shou)先(xian)檢(jian)測(ce)傳(chuan)統(tong)類器(qi)官(guan)對(dui)順(shun)鉑的(de)敏感(gan)性(xing)，測得肺(fei)癌(ai)類器(qi)官(guan)半(ban)抑(yi)制(zhi)濃(nong)度(du)（IC50）為(wei)29.88μmol/L（圖(tu)3a）。隨後采用10μmol/L順(shun)鉑處理(li)厘(li)米級模型(xing)，藥(yao)物幹(gan)預(yu)5天後即(ji)出(chu)現(xian)大規(gui)模腫瘤細胞死(si)亡(wang)（圖(tu)3d-e）；持(chi)續暴(bao)露(lu)10天後癌(ai)細胞被清除（圖(tu)3b-c）。免疫熒(ying)光成(cheng)像揭(jie)示，同(tong)等(deng)劑(ji)量(liang)順(shun)鉑在厘米(mi)級(ji)類器(qi)官(guan)中(zhong)誘(you)導的(de)雕亡(wang)信(xin)號強(qiang)度(du)顯(xian)著高於傳(chuan)統(tong)模型(xing)（圖(tu)3f-g），證(zheng)實厘米(mi)級體系(xi)對(dui)順(shun)鉑的(de)響(xiang)應(ying)靈敏(min)度(du)更高。

04 子宮(gong)內膜癌(ai)類器(qi)官(guan)構(gou)建(jian)及藥(yao)敏檢測(ce)

為實現(xian)子宮(gong)內膜微(wei)生(sheng)理系(xi)統的(de)高度(du)模擬，本(ben)研(yan)究(jiu)充分利(li)用微流(liu)控(kong)技術在透光性(xing)能及(ji)氣(qi)體(ti)滲透性(xing)方面(mian)的(de)優(you)勢(shi)，構(gou)建了壹(yi)種(zhong)整合(he)血(xue)管網(wang)絡的(de)子宮(gong)內膜癌(ai)體外(wai)模型(xing)（圖(tu)4a）。團隊通(tong)過類器(qi)官(guan)芯(xin)片模擬子宮(gong)內膜血(xue)管網(wang)絡，有效(xiao)支(zhi)持(chi)球狀(zhuang)體類器(qi)官(guan)的(de)營養供給。培(pei)養超過15天後，源自患者(zhe)的(de)子宮(gong)內膜癌(ai)細胞成(cheng)功組(zu)建(jian)出(chu)具備(bei)緊密(mi)連接(jie)的(de)組(zu)織學(xue)結構，其形態(tai)特征高(gao)度(du)再現(xian)了體(ti)內腫瘤的(de)實際情(qing)況（圖(tu)4b-c）；相較之下，無灌註(zhu)的(de)對(dui)照組(zu)類器(qi)官(guan)則(ze)生(sheng)長(chang)停(ting)滯並最(zui)終解體。病(bing)理(li)染(ran)色(se)證(zheng)實了模型(xing)保留(liu)源腫瘤的(de)關鍵病(bing)理特征，同(tong)時通(tong)過孕酮(tong)受(shou)體(ti)（PR）、雌(ci)激(ji)素(su)受(shou)體(ti)（ER）和(he)細胞角(jiao)蛋(dan)白7（CK7）的(de)免疫熒(ying)光染(ran)色(se)結果，進(jin)壹(yi)步(bu)明(ming)確(que)了模型(xing)的(de)子宮(gong)內膜癌(ai)特性(xing)（圖(tu)4d-e）。

在藥(yao)物反(fan)應(ying)評(ping)估(gu)方(fang)面(mian)，相(xiang)較於傳(chuan)統(tong)類器(qi)官(guan)模型(xing)，本(ben)研(yan)究(jiu)的(de)厘米(mi)級(ji)類器(qi)官(guan)在相同(tong)卡(ka)鉑濃度(du)下表(biao)現(xian)出(chu)顯(xian)著增強的(de)藥(yao)物敏感(gan)性(xing)（圖(tu)4g-j）。該(gai)平臺(tai)還(hai)可實現(xian)長(chang)期藥(yao)效(xiao)監(jian)測：如(ru)圖(tu)4k所示(shi)，隨(sui)卡(ka)鉑濃度(du)升高(gao)，厘米級類器(qi)官(guan)細胞快速死(si)亡(wang)。這(zhe)表(biao)明子宮(gong)內膜癌(ai)厘米(mi)級類器(qi)官(guan)芯(xin)片不僅(jin)突破腫瘤生(sheng)長(chang)尺寸(cun)限制(zhi)，更精(jing)準(zhun)模擬腫瘤微(wei)環(huan)境(jing)，還(hai)為藥(yao)物療(liao)效(xiao)評(ping)估(gu)提供(gong)了更可靠(kao)的(de)模型(xing)基(ji)礎(chu)。

05 腎(shen)臟(zang)類器(qi)官(guan)培(pei)養與腎(shen)毒(du)性(xing)檢測(ce)

本(ben)研(yan)究(jiu)進(jin)壹步(bu)將(jiang)毛細血(xue)管芯(xin)片技術應(ying)用於腎(shen)臟(zang)類器(qi)官(guan)培(pei)養領域（圖(tu)5a-d）。H&E染(ran)色(se)結果表(biao)明，厘米(mi)級(ji)腎(shen)臟(zang)模型(xing)保留(liu)了原(yuan)始(shi)腎(shen)臟(zang)的(de)組(zu)織學(xue)結構特征（圖(tu)5e）；通(tong)過免疫熒(ying)光檢測(ce)，該(gai)模型(xing)明(ming)確(que)表(biao)達(da)了遠端(duan)腎(shen)小(xiao)管(guan)標誌物LRP2以及腎(shen)臟(zang)遠端(duan)小(xiao)管(guan)標誌物E-鈣(gai)黏(nian)蛋(dan)白（ECAD）（圖(tu)5f-g）。

為動態(tai)評(ping)估(gu)順(shun)鉑的(de)腎(shen)毒(du)性(xing)效(xiao)應(ying)，研究(jiu)采用綠色(se)熒(ying)光蛋(dan)白（GFP）標記(ji)厘米(mi)級(ji)腎(shen)臟(zang)類器(qi)官(guan)以監(jian)測細胞增殖狀(zhuang)態(tai)（圖(tu)5h）。經(jing)30天培(pei)養的(de)模型(xing)中(zhong)施加(jia)順(shun)鉑處理(li)後，第4天即(ji)觀(guan)察到細胞死(si)亡(wang)現(xian)象，類器(qi)官(guan)結構瓦(wa)解並形成(cheng)囊泡樣改(gai)變，精(jing)準(zhun)模擬了順(shun)鉑暴(bao)露(lu)下近(jin)端腎(shen)小(xiao)管(guan)典型(xing)的(de)擴張(zhang)病(bing)理(li)特征（圖(tu)5h-i）；藥(yao)物暴(bao)露(lu)超過10天後，細胞死(si)亡(wang)率(lv)＞50%（圖(tu)5j）。上(shang)述發現(xian)證(zheng)實，毛細血(xue)管芯(xin)片技術可成(cheng)功構建(jian)具備(bei)天然(ran)腎(shen)臟(zang)組(zu)織特性(xing)的(de)厘米(mi)級(ji)類器(qi)官(guan)芯(xin)片，並能(neng)精(jing)確(que)復現(xian)順(shun)鉑誘導的(de)腎(shen)毒(du)性(xing)反(fan)應(ying)機制(zhi)。

06 微血(xue)管提升類器(qi)官(guan)基(ji)因(yin)遞(di)送效(xiao)率(lv)

盡(jin)管(guan)類器(qi)官(guan)展(zhan)現(xian)出(chu)高(gao)度(du)仿生(sheng)的(de)生(sheng)物學(xue)特性(xing)，其培(pei)養基質形成(cheng)的(de)細胞外物理屏障(zhang)卻阻礙(ai)了病(bing)毒(du)顆粒的(de)直接(jie)侵(qin)染(ran)，導致重組(zu)腺(xian)相(xiang)關病毒(du)載(zai)體（rAAV）在基因(yin)療(liao)法(fa)中的(de)應(ying)用受(shou)限。為模擬體內血(xue)管化(hua)腫瘤對(dui)病毒(du)感(gan)染(ran)的(de)敏感(gan)性(xing)，本(ben)研(yan)究(jiu)通(tong)過微流(liu)控(kong)系統遞(di)送rAAV-GFP並(bing)評(ping)估(gu)感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)（圖(tu)6a-b）。通(tong)過向厘(li)米(mi)級類器(qi)官(guan)緩(huan)慢(man)註(zhu)入新(xin)鮮病毒(du)懸(xuan)液(ye)實現(xian)深(shen)度(du)滲(shen)透並(bing)與細胞充分作用，經(jing)48小(xiao)時持(chi)續感(gan)染(ran)後，基於GFP陽性(xing)細胞比率(lv)評(ping)估(gu)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率(lv)。結果顯(xian)示(shi)，厘米級(ji)類器(qi)官(guan)的(de)GFP陽性(xing)細胞數(shu)量(liang)及熒(ying)光強度(du)比率(lv)均(jun)顯(xian)著高於傳(chuan)統(tong)類器(qi)官(guan)（圖(tu)6c-d），表(biao)明血(xue)管化(hua)裝(zhuang)置(zhi)顯(xian)著增強病(bing)毒(du)侵(qin)染(ran)能力(li)（圖(tu)6e），且轉染(ran)後類器(qi)官(guan)仍(reng)保持(chi)良好(hao)增殖活性(xing)。該(gai)厘米級(ji)類器(qi)官(guan)體(ti)系(xi)為開(kai)發基於rAAV的(de)新(xin)型(xing)基(ji)因(yin)治(zhi)療(liao)策(ce)略(lve)提供(gong)了創新(xin)平臺(tai)，有望加速基(ji)因(yin)療(liao)法(fa)臨床轉(zhuan)化(hua)並提升治(zhi)療(liao)效(xiao)益。

總(zong)結：

本(ben)研(yan)究(jiu)展(zhan)示了利(li)用摩方微納(na)3D打印(yin)技術（microArch® S230，精(jing)度(du)：2μm）制(zhi)造(zao)用於器(qi)官(guan)芯(xin)片應(ying)用的(de)生(sheng)物芯(xin)片。該(gai)技術能(neng)夠(gou)最大(da)限度(du)地(di)模擬微血(xue)管網(wang)絡結構，更真(zhen)實地模擬血(xue)液(ye)循(xun)環(huan)過程(cheng)以及關鍵營養物質、氧(yang)氣(qi)輸(shu)送(song)和(he)代(dai)謝廢物(wu)清除過程(cheng)。應(ying)用微流(liu)控(kong)灌註(zhu)技術構(gou)建的(de)器(qi)官(guan)芯(xin)片，成(cheng)功實現(xian)了腫瘤與(yu)腎(shen)臟(zang)類器(qi)官(guan)的(de)長(chang)期體(ti)外(wai)培(pei)養周(zhou)期突破30天，同(tong)時將(jiang)組(zu)織尺寸(cun)擴(kuo)展至(zhi)厘米級(ji)。這(zhe)壹(yi)突破性(xing)進展(zhan)克服了傳(chuan)統(tong)培(pei)養方法中類器(qi)官(guan)尺(chi)寸(cun)受(shou)限的(de)瓶頸，為(wei)藥(yao)物毒(du)性(xing)測試(shi)及藥(yao)效(xiao)評(ping)估(gu)建(jian)立了高(gao)仿生(sheng)性(xing)研究(jiu)平臺(tai)。