微(wei)納3D打印(yin)：創新(xin)仿生(sheng)血(xue)管(guan)化肝臟芯(xin)片(pian)

在藥物(wu)研發(fa)和(he)疾(ji)病治療(liao)領(ling)域，肝臟作(zuo)為藥物(wu)代(dai)謝的(de)核(he)心器(qi)官，其功(gong)能(neng)模(mo)擬(ni)壹直是科(ke)研界(jie)關註(zhu)的(de)焦點(dian)。傳(chuan)統(tong)藥物(wu)評(ping)估依(yi)賴(lai)動物(wu)實(shi)驗和(he)臨床(chuang)反饋(kui)，成(cheng)本高、周(zhou)期(qi)長，而(er)器(qi)官芯片(pian)技(ji)術(shu)的(de)興起(qi)為體(ti)外(wai)模(mo)擬(ni)人體(ti)生(sheng)理提(ti)供了新途(tu)徑。

近(jin)日(ri)，中國(guo)科(ke)學院(yuan)大(da)學(xue)溫(wen)州(zhou)研究所、南(nan)京大(da)學(xue)醫學(xue)院(yuan)、河(he)南(nan)省科(ke)學院(yuan)等聯(lian)合(he)研究團隊提(ti)出(chu)了壹種基(ji)於高精度(du)3D打印(yin)的(de)仿生(sheng)血(xue)管(guan)化肝臟芯(xin)片(pian)，通過模(mo)擬(ni)肝小(xiao)葉的(de)復(fu)雜結(jie)構(gou)，實(shi)現了高效(xiao)藥物(wu)誘(you)導肝損(sun)傷(shang)（DILI）篩查。該(gai)技(ji)術(shu)依(yi)托摩(mo)方精密面投影(ying)微(wei)立(li)體(ti)光（PμSL）技(ji)術(shu)構(gou)建了微血(xue)管(guan)網絡，為肝臟生(sheng)理研究帶來了革(ge)命性(xing)進(jin)展。該(gai)研究以“Microperfused Biomimetic Liver-on-a-Chip for High-Throughput Hepatotoxicity Screening"為題(ti)，發(fa)表於國際期(qi)刊(kan)《Small》上。

肝臟芯(xin)片(pian)的(de)核(he)心挑戰在於如(ru)何更(geng)精確地模(mo)擬(ni)肝臟的(de)生(sheng)理環境。傳(chuan)統(tong)芯片(pian)設(she)計僅實(shi)現簡單(dan)的(de)多細(xi)胞(bao)共(gong)培養和(he)物(wu)質(zhi)交換(huan)，難(nan)以復現肝小(xiao)葉的(de)精(jing)細(xi)結(jie)構(gou)。本研究從肝小(xiao)葉的(de)徑向(xiang)肝板(ban)和(he)血(xue)竇分(fen)布中(zhong)獲得(de)靈感(gan)，利用摩方精密的(de)microArch® S230（精(jing)度(du)：2 μm）打印(yin)出具(ju)有(you)多層(ceng)毛(mao)細(xi)血(xue)管(guan)網絡的(de)芯(xin)片(pian)。芯(xin)片(pian)內(nei)部(bu)包(bao)含(han)五層(ceng)結(jie)構(gou)，每(mei)層設(she)有(you)14條(tiao)平(ping)行毛(mao)細(xi)通道，通道直徑仿照(zhao)血(xue)管(guan)設(she)計，內徑80 μm、外(wai)徑120 μm，並(bing)分(fen)布有(you)梯形(xing)微(wei)孔(kong)（長(chang)度(du)約10 μm，間隔300 μm），確保(bao)營(ying)養和(he)氧氣(qi)的(de)均(jun)勻擴散(san)（圖(tu)2）。

這壹仿生(sheng)設(she)計通過微(wei)流(liu)體(ti)灌註(zhu)系統維(wei)持細(xi)胞(bao)環境的(de)穩(wen)定。芯(xin)片(pian)安(an)裝(zhuang)於定制(zhi)夾(jia)具(ju)中(zhong)，連(lian)接(jie)微(wei)註(zhu)射泵實(shi)現連(lian)續灌註(zhu)，模(mo)擬(ni)體(ti)內血(xue)液流(liu)動。實(shi)驗顯(xian)示，在微灌註(zhu)條(tiao)件(jian)下，人誘(you)導多能(neng)幹(gan)細(xi)胞(bao)衍生(sheng)的(de)肝細(xi)胞(bao)（hiPSC-Heps）相比傳(chuan)統(tong)2D培養表現出更(geng)優(you)的(de)生(sheng)理狀(zhuang)態(tai)和(he)功(gong)能(neng)。hiPSC-Heps通過階(jie)段(duan)性(xing)細(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)誘(you)導分(fen)化，從(cong)定型(xing)內胚(pei)層經肝祖(zu)細(xi)胞(bao)成熟(shu)為肝細(xi)胞(bao)，其白蛋白(bai)（ALB）和(he)尿素(su)合(he)成(cheng)能(neng)力顯(xian)著提(ti)升(sheng)，且基(ji)因(yin)表達水平(ping)接近(jin)原(yuan)代(dai)人肝細(xi)胞(bao)（PHHs）。

細(xi)胞(bao)培養實(shi)驗進(jin)壹步(bu)驗證(zheng)了芯片(pian)的(de)優(you)異(yi)性(xing)。hiPSC-Heps在3D芯片(pian)中(zhong)培養7天後，活死(si)染色顯示細(xi)胞(bao)存(cun)活率高(gao)達90%以上，而(er)2D培養因(yin)接(jie)觸抑制(zhi)導致(zhi)大(da)量(liang)死(si)亡(wang)。免疫熒光(guang)染色表明，3D培養的(de)細(xi)胞(bao)高表達HNF4A、PCNA等增(zeng)殖(zhi)標(biao)記，以及ALB和(he)CYP3A4等肝功(gong)能(neng)關鍵(jian)蛋(dan)白。功(gong)能(neng)上，3D培養細(xi)胞(bao)的(de)ALB分(fen)泌(mi)穩(wen)定，尿(niao)素(su)合(he)成(cheng)持(chi)續增長，且糖原(yuan)儲(chu)存(cun)和(he)吲(yin)哚(duo)菁(jing)綠(lv)（ICG）轉運(yun)能(neng)力顯(xian)著優(you)於2D對照(zhao)組。這些結(jie)果凸(tu)顯了3D微環境在促進(jin)細(xi)胞(bao)極性(xing)和(he)功(gong)能(neng)成(cheng)熟(shu)中的(de)作(zuo)用（圖(tu)4）。

為模(mo)擬(ni)肝臟的(de)復(fu)雜微(wei)環(huan)境，研究還構(gou)建了hiPSC-Heps、肝星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)（LX-2）和(he)人臍(qi)靜脈(mai)內皮細(xi)胞(bao)（HUVECs）的(de)共(gong)培養系統。HUVECs自(zi)組裝形(xing)成(cheng)血(xue)管(guan)網絡，與肝細(xi)胞(bao)交互(hu)作用，仿照(zhao)Disse空間結(jie)構(gou)。共(gong)培養條(tiao)件(jian)下，肝細(xi)胞(bao)的(de)ALB和(he)尿素(su)合(he)成(cheng)能(neng)力進(jin)壹步(bu)提(ti)升(sheng)，且藥物(wu)代(dai)謝相關基(ji)因(yin)表達上調(tiao)，證(zheng)實(shi)了多細(xi)胞(bao)協同(tong)對肝功(gong)能(neng)的(de)增(zeng)強效(xiao)應(ying)（圖(tu)5）。

在應(ying)用層面，研究團隊集(ji)成濃(nong)度(du)梯度(du)芯片(pian)與肝臟芯(xin)片(pian)，建立(li)了高通量(liang)DILI篩查平(ping)臺。濃(nong)度(du)梯度(du)芯片(pian)通過五通道設(she)計生(sheng)成0-40 mM的(de)對(dui)乙酰(xian)氨(an)基(ji)酚（APAP）梯度(du)，用於模(mo)擬(ni)急性(xing)和(he)慢性(xing)肝損(sun)傷(shang)。結(jie)果顯(xian)示，3D灌註(zhu)培養系統對(dui)APAP毒性(xing)更(geng)敏感，在20 mM以上濃(nong)度(du)時細(xi)胞(bao)死(si)亡(wang)率超(chao)過80%，且谷胱(guang)甘肽(tai)（GSH）水平(ping)下降(jiang)，ALT和(he)AST指標(biao)升(sheng)高。慢性(xing)毒性(xing)實(shi)驗中(zhong)，低濃(nong)度(du)APAP長期(qi)暴(bao)露(lu)導致(zhi)細(xi)胞(bao)活性(xing)逐(zhu)漸(jian)喪(sang)失(shi)，證(zheng)明該平(ping)臺能(neng)有(you)效(xiao)預測藥(yao)物(wu)毒(du)性(xing)的(de)時(shi)間依(yi)賴(lai)性(xing)（圖(tu)6）。

總結(jie)：這項(xiang)研究通過摩(mo)方精密微納3D打印(yin)技(ji)術(shu)打造的(de)仿生(sheng)血(xue)管(guan)化肝臟芯(xin)片(pian)，不僅高(gao)度(du)模(mo)擬(ni)了肝臟生(sheng)理結(jie)構(gou)，還提(ti)升(sheng)了細(xi)胞(bao)功(gong)能(neng)和(he)藥物(wu)篩(shai)查效(xiao)率。未來，通過內(nei)皮化血(xue)管(guan)網絡和(he)空間分(fen)區設(she)計，該芯片(pian)有(you)望(wang)發(fa)展(zhan)為肝衰竭(jie)模(mo)型(xing)，推動肝臟疾(ji)病機(ji)制(zhi)研究和(he)藥物(wu)開發(fa)。這壹創新(xin)平臺(tai)為藥物(wu)毒(du)性(xing)評(ping)估提(ti)供了高效(xiao)、可靠的(de)體(ti)外(wai)工(gong)具(ju)，展(zhan)現了器(qi)官芯片(pian)技(ji)術(shu)在精準(zhun)醫療(liao)中(zhong)的(de)廣(guang)闊前(qian)景。