三合壹(yi)雙(shuang)層微針貼片(pian)，用(yong)於超(chao)聲激(ji)活(huo)抗(kang)菌治(zhi)療(liao)和傷口愈(yu)合中(zhong)的免疫調(tiao)節(jie)

致病性(xing)細(xi)菌感染(ran)對公(gong)共(gong)衛(wei)生構成(cheng)嚴(yan)重(zhong)威脅(xie)，特別是(shi)在(zai)慢(man)性和急(ji)性(xing)傷口中，細菌(jun)的定植(zhi)和生物(wu)膜的形成(cheng)使得(de)傷口愈(yu)合變(bian)得(de)更(geng)加困(kun)難(nan)。基於活性氧（ROS）的療法具有(you)廣譜(pu)抗(kang)菌(jun)活性(xing)和低耐藥性(xing)的優勢，現(xian)已(yi)成(cheng)為(wei)壹(yi)種(zhong)治(zhi)療感(gan)染創面(mian)的非抗(kang)生素策略。然而，其臨床應(ying)用(yong)仍(reng)受限於給藥效(xiao)率(lv)低、細(xi)菌(jun)靶(ba)向(xiang)性(xing)差(cha)及治療(liao)後炎癥(zheng)失控(kong)等(deng)問題。

為(wei)此，武漢(han)大(da)學藥學院(yuan)黎(li)威(wei)教授(shou)團隊設(she)計(ji)了(le)壹(yi)種(zhong)多功能雙(shuang)層微針貼片(pian)（LFT/S-MN），旨在(zai)有(you)效(xiao)滅菌(jun)並促(cu)進傷口愈(yu)合。該(gai)貼片(pian)將帶正(zheng)電荷的乳鐵蛋(dan)白基(ji)納米(mi)粒子（LFT NPs）與卟啉(lin)聲敏(min)劑(ji)（TAPPFe）結合，放置在(zai)可(ke)溶解的基底(di)層中，同時(shi)在pH響應(ying)的針尖(jian)層中加載抗(kang)炎藥物(wu)spermidine（SPD）。當(dang)微針插入感染(ran)組織後，釋放的LFT NPs能夠(gou)有(you)效(xiao)靶(ba)向(xiang)並聚集負電(dian)荷細(xi)菌(jun)，在超(chao)聲刺激下通(tong)過協(xie)同的化學動(dong)力(li)和聲動(dong)力(li)療(liao)法（CDT/SDT）生成(cheng)大(da)量(liang)的ROS。同時(shi)，傷口的酸性(xing)微(wei)環境(jing)觸發了(le)針(zhen)尖層的逐步(bu)降解，從而實(shi)現(xian)SPD的控制釋(shi)放，進(jin)行免疫調(tiao)節(jie)。在銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌（P. aeruginosa）感(gan)染的小鼠傷口模(mo)型(xing)中(zhong)，LFT/S-MN貼(tie)片(pian)顯著減(jian)少(shao)了(le)細(xi)菌負荷，抑(yi)制了(le)炎(yan)癥反應(ying)，促(cu)進(jin)了(le)膠(jiao)原蛋(dan)白沈(chen)積(ji)和新生血管形(xing)成(cheng)，並加(jia)速了(le)傷口閉合。

這(zhe)項(xiang)工作提(ti)出了(le)壹(yi)種(zhong)有(you)前景(jing)的非抗(kang)生素策略，通(tong)過協(xie)同的CDT/SDT和炎(yan)癥(zheng)調(tiao)節(jie)實(shi)現(xian)傷口抗菌與(yu)組織再(zai)生。該(gai)微針(zhen)貼片(pian)是利用(yong)摩(mo)方(fang)精(jing)密面投(tou)影(ying)微立(li)體(ti)光刻(ke)（PμSL）技(ji)術(shu)（microArch® S240，精度(du)：10 μm）3D打印(yin)加工模(mo)具後經PDMS翻(fan)模(mo)制備(bei)而成(cheng)，相關(guan)研(yan)究(jiu)成(cheng)果以“Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing"為(wei)題發表在期刊《Journal of Controlled Release》上(shang)。武漢(han)大(da)學藥學院(yuan)2023級博(bo)士研(yan)究(jiu)生姜(jiang)鵬(peng)為(wei)論(lun)文作者，黎(li)威(wei)教授(shou)為(wei)論(lun)文通(tong)訊作(zuo)者(zhe)，武漢(han)大(da)學藥學院(yuan)為(wei)論(lun)文完(wan)成(cheng)單位，以上(shang)研(yan)究(jiu)工作得(de)到(dao)了(le)國(guo)家自(zi)然科(ke)學基(ji)金項目(mu)和武漢(han)大(da)學泰康生命(ming)醫(yi)學中(zhong)心(xin)PI經費(fei)的支持(chi)。

如圖1所示(shi)，該(gai)貼片(pian)在可(ke)溶解基層中集成(cheng)了(le)與(yu)卟啉(lin)聲敏(min)劑(ji)（TAPPFe）偶(ou)聯的帶正(zheng)電(dian)荷的乳鐵蛋(dan)白納米(mi)顆(ke)粒（LFT NP），以(yi)及(ji)負載(zai)抗(kang)炎(yan)劑(ji)亞(ya)精胺(an)（SPD）的pH響應(ying)尖(jian)層。插入感染(ran)組織後，釋放的 LFT NP 有(you)效(xiao)地靶(ba)向(xiang)並聚集帶負電(dian)荷的細菌(jun)，從(cong)而在(zai)超(chao)聲刺激下通(tong)過協(xie)同化學動(dong)力(li)學和聲動(dong)力(li)學療(liao)法（CDT/SDT）產(chan)生強(qiang)大(da)的 ROS。同時(shi)，酸性傷口微環境(jing)觸發尖(jian)層的逐漸(jian)降解，可(ke)控(kong)的SPD 釋放以(yi)進行免疫調(tiao)節(jie)。在銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌感(gan)染的小鼠傷口模(mo)型(xing)中(zhong)，LFT/S-MN 貼(tie)片(pian)顯著降低了(le)細(xi)菌載量(liang)，抑(yi)制了(le)炎(yan)癥，促進了(le)膠(jiao)原蛋(dan)白沈(chen)積(ji)和新生血管形(xing)成(cheng)，並加(jia)速了(le)傷口閉合。

圖1. LFT/S-MN貼片(pian)治療(liao)感染傷口的結構和治(zhi)療(liao)機制示(shi)意(yi)圖。（A）雙(shuang)層LFT/S-MN貼片的設(she)計(ji)和制備(bei)是(shi)由負載(zai)正(zheng)電(dian)荷LFT NPs的可(ke)溶基底(di)層和封(feng)裝SPD的pH響應(ying)尖(jian)層組成(cheng)。（B）插入感染(ran)創面(mian)後，基底(di)層迅(xun)速溶解釋放LFT NPs， LFT NPs積(ji)極靶(ba)向(xiang)帶(dai)負電(dian)荷的細菌(jun)，並通(tong)過協(xie)同SDT和CDT在(zai)US下(xia)產(chan)生ROS，實(shi)現(xian)有(you)效(xiao)的細菌(jun)除(chu)去。同(tong)時(shi)，酸性傷口微環境(jing)觸發尖(jian)層降解，導(dao)致SPD持續(xu)釋(shi)放，用(yong)於炎癥調(tiao)節(jie)。這(zhe)種(zhong)聯合(he)策(ce)略促(cu)進(jin)細菌(jun)清(qing)除(chu)、免疫調(tiao)節(jie)和組織再(zai)生，最終加(jia)速傷口愈(yu)合。

為(wei)了(le)實(shi)現(xian)位點特異性和控(kong)制藥物(wu)釋(shi)放，使(shi)用(yong)順序成(cheng)型策略制備(bei)了(le)pH響應(ying)雙(shuang)層MN貼片，稱為(wei)LFT/S-MN貼片。為(wei)了(le)可(ke)視(shi)化和結構驗(yan)證(zheng)，兩(liang)個(ge)熒(ying)光(guang)探(tan)針(zhen)，羅丹(dan)明(ming)B標記(ji)的牛血清(qing)白(bai)蛋(dan)白（RhB-BSA）和異硫(liu)氰(qing)酸熒(ying)光(guang)素（FITC），分別裝載到(dao)納米(mi)顆(ke)粒的尖和基(ji)底(di)層（圖2A和B）。尖(jian)層是通(tong)過紫(zi)外誘導(dao)自(zi)由基聚合和甲(jia)基(ji)丙(bing)烯酸(suan)殼(ke)聚糖（CSMA）與(yu)SPDTA之(zhi)間(jian)的席夫堿(jian)交(jiao)聯合(he)成(cheng)的，基底(di)層由18 wt%的聚乙烯(xi)醇(chun)（PVA）和蔗(zhe)糖(tang)溶液組成(cheng)，背襯層由20 wt%的聚苯(ben)乙(yi)烯(xi)（PS）組成(cheng)。能量(liang)色散(san)X射(she)線(xian)能(neng)譜(pu)（EDS）分(fen)析(xi)（圖2C）表明，來自(zi)LFT NPs的鐵元素分布均勻(yun)，局(ju)限於基底層，而尖(jian)層的碳元素分布均勻(yun)，表明明顯的空(kong)間分離(li)。得(de)到(dao)的LFT/S-MN貼片(pian)由壹(yi)個(ge)10 × 10 MN陣(zhen)列組成(cheng)，跨(kua)度(du)約0.5 cm2（圖2D）。每根(gen)針都具有(you)明確的圓錐(zhui)形(xing)形態(tai)，高度(du)約850 μm，具有(you)明顯(xian)的雙(shuang)層結構（圖2E和F）。力(li)學測試(shi)顯示，每根針(zhen)的斷裂(lie)力(li)約(yue)為(wei)4N（圖2G），足以(yi)實(shi)現(xian)有(you)效(xiao)的經皮(pi)插入和潛(qian)在(zai)的臨床應(ying)用(yong)。

圖2. LFT/S-MN貼片(pian)的表征。（A-B）LFT/S-MN貼片的代表性明場和熒(ying)光(guang)圖像，說明了(le)摻(chan)入成(cheng)分的結構完(wan)整(zheng)性和熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)。（C）能(neng)譜(pu)圖證實(shi)了(le)MNs內(nei)元素的分布(bu)。（D）光(guang)學圖像和（E, F）SEM圖像顯示(shi)LFT/S-MNs的形貌(mao)。黃(huang)色虛(xu)線表示ph響應(ying)尖(jian)層和可(ke)溶解基層之(zhi)間(jian)的界面(mian)。（G）LFT/S-MNs的力(li)-位移曲(qu)線(xian)，表明其機械強(qiang)度(du)適(shi)合(he)皮膚穿(chuan)透(tou)。

采用(yong)離(li)體(ti)豬皮(pi)評(ping)價LFT/S-MN貼片的皮膚(fu)穿(chuan)透(tou)能(neng)力(li)。應(ying)用(yong)後，MNs成(cheng)功突破(po)角質層，並將封裝的熒(ying)光(guang)染(ran)料(liao)輸(shu)送(song)到(dao)皮(pi)膚(fu)中(zhong)，熒(ying)光(guang)成(cheng)像顯示(shi)（圖3A），組織學橫(heng)截面(mian)證(zheng)實(shi)（圖3B）。通(tong)過熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀(guan)察(cha)LFT NPs的溶出行為(wei)和隨(sui)後的釋放。如圖3C所示(shi)，基層在80秒內溶解在PBS（pH 7.4）中，促進(jin)LFT NPs從(cong)MN基(ji)中快(kuai)速釋(shi)放。考慮(lv)到(dao)感(gan)染(ran)的傷口微環境(jing)通(tong)常是酸性(xing)的，作者(zhe)進(jin)壹(yi)步(bu)研(yan)究(jiu)了(le)MN尖(jian)的pH響應(ying)行(xing)為(wei)。體(ti)外釋(shi)放研(yan)究(jiu)表明，尖層在輕度(du)酸性(xing)條(tiao)件下（pH 5.6）逐(zhu)漸(jian)降解，到(dao)第(di)15天(tian)幾(ji)乎(hu)分(fen)解，而在(zai)中性條(tiao)件下（pH 7.4）發生最小降解（圖3D），表明尖層的酸敏(min)感(gan)行為(wei)。定量(liang)測定藥物(wu)裝載和遞(di)送(song)效(xiao)率(lv)（圖3E和F）。LFT為(wei)145.43 ± 2.76 μg，SPD為(wei)14.96 ± 0.08 μg。經皮膚給(gei)藥後，LFT經MNs給(gei)藥量(liang)為(wei)132.83 ± 2.91 μg，SPD經MNs給藥量(liang)為(wei)14.38 ± 0.22 μg，兩種(zhong)藥物(wu)的給藥效(xiao)率(lv)均超(chao)過90%。此(ci)外，SPD在酸(suan)性(xing)條(tiao)件（pH 5.6）下的累積(ji)釋放量(liang)在(zai)第(di)15天(tian)達到(dao)88.87 ± 3.58%，顯(xian)著(zhu)高於PBS（pH 7.4），進壹(yi)步(bu)證(zheng)實(shi)了(le)MN尖(jian)的酸響應(ying)釋(shi)放譜(pu)（圖3G）。

圖3. LFT/S-MN貼片(pian)的藥物(wu)釋(shi)放評(ping)價。（A）LFT/S-MN貼片植(zhi)入後豬離(li)體(ti)皮膚(fu)的代表性亮(liang)場(chang)和熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)圖像。（B）MN貼片(pian)植(zhi)入後的豬皮(pi)膚(fu)組織學切片。（C）光學圖像顯示(shi)了(le)80秒(miao)內PBS中基底(di)層的快速溶解和尖(jian)層的分離(li)。（D）倒置熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)圖像顯示(shi)在(zai)不同pH條(tiao)件下（pH 7.4和5.6），模(mo)擬(ni)中(zhong)性和輕度(du)酸性(xing)傷口環境(jing)下(xia)，MN在15天內(nei)降解。（E） LFT/S-MN貼片LFT裝載和遞(di)送(song)的量(liang)化。（F） LFT/S-MN貼片SPD裝載和遞(di)送(song)的量(liang)化。（G） LFT/S-MNs中SPD隨(sui)時(shi)間的體(ti)外累(lei)積(ji)釋放曲(qu)線(xian)。數據(ju)以(yi)mean ± SD表示（n = 3個(ge)獨立樣本(ben)）。

作(zuo)者(zhe)系(xi)統(tong)評價了(le)LFT/S-MN貼(tie)片的體(ti)外抗(kang)菌(jun)效(xiao)果。如圖4D所示(shi)，超(chao)聲照射（3 MHz, 0.97 W/cm2，50%占空(kong)比(bi)，30 min）下(xia)LFT的最小抑(yi)制濃度(du)（MIC）為(wei)128 μg/mL。單獨的LFT/S-MN貼片(pian)表現(xian)出中等(deng)的抗菌(jun)活(huo)性，對金黃(huang)色葡(pu)萄球菌(jun)的抑(yi)制率(lv)為(wei)36.41 ± 0.75%，對銅綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌的抑(yi)制率(lv)為(wei)35.87 ± 1.48%（圖4A和E）。相(xiang)比(bi)之(zhi)下(xia)，超(chao)聲波(bo)激(ji)活(huo)後，LFT/S-MN貼片(pian)的抑(yi)菌率(lv)顯著(zhu)提(ti)高，分(fen)別為(wei)99.95 ± 0.04%和99.96 ± 0.04%（圖4E），表明細菌幾(ji)乎(hu)失(shi)活(huo)。SYTO 9/PI染色進(jin)壹(yi)步(bu)驗(yan)證了(le)這(zhe)些(xie)結果，其中LFT/S-MN US組顯(xian)示出主要(yao)的紅(hong)色熒(ying)光(guang)，表明廣泛的細菌(jun)死亡(wang)（圖4B和F）。掃(sao)描(miao)電鏡(jing)（SEM）提(ti)供了(le)額(e)外的形態(tai)學證(zheng)據(ju)；未(wei)處理(li)組的細菌(jun)保(bao)持了(le)完(wan)整(zheng)和光(guang)滑(hua)的膜，而暴露於超(chao)聲激(ji)活(huo)的LFT/S-MN的細菌(jun)則(ze)表現(xian)出明顯(xian)的結構破(po)壞和膜破(po)裂（圖4C）。總的來說，這(zhe)些(xie)發現(xian)證(zheng)實(shi)，超(chao)聲激(ji)活(huo)後，LFT/S-MN貼片(pian)可(ke)以(yi)產(chan)生大(da)量(liang)的局部ROS，從而在(zai)病變部位有(you)效(xiao)地消(xiao)滅細(xi)菌。

圖4. LFT/S-MN貼片(pian)體(ti)外抗(kang)菌(jun)性(xing)能研(yan)究(jiu)。（A）瓊脂板(ban)的代表性照片，顯示LFT/S-MNs對(dui)金黃(huang)色葡(pu)萄球菌(jun)和銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌的抗菌(jun)效(xiao)果。（B）熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)圖像顯示(shi)金黃(huang)色葡(pu)萄球菌(jun)和銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌在(zai)不同(tong)處理(li)條(tiao)件下產(chan)生ROS引(yin)起(qi)的氧化應(ying)激(ji)。（C）處理(li)後細菌(jun)形態(tai)的SEM圖像，顯示(shi)金黃(huang)色葡(pu)萄球菌(jun)和銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌的膜破(po)壞和結構變(bian)形(xing)。（D）LFT在(zai)LFT/S-MNs中對金黃(huang)色葡(pu)萄球菌(jun)的最小抑(yi)制濃度(du)（MIC），顯示(shi)出劑量(liang)依(yi)賴(lai)性(xing)的抗菌(jun)活(huo)性。紅(hong)色箭(jian)頭表示LFT的MIC值(zhi)。（E）不同(tong)處理(li)後細菌(jun)活力(li)的定量(liang)分(fen)析(xi)，通(tong)過活(huo)/死染(ran)色評(ping)估。（F）活(huo)/死實(shi)驗(yan)中(zhong)相(xiang)應(ying)的綠(lv)色熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)（FI）測量(liang)結果，進(jin)壹(yi)步(bu)證(zheng)實(shi)了(le)抗(kang)菌作用(yong)。數(shu)據(ju)顯(xian)示以(yi)mean ± SD（n = 3個(ge)獨立樣本(ben)）。** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示無(wu)顯著(zhu)性(xing)。

為(wei)了(le)驗(yan)證LFT/S-MN貼片的體(ti)內治(zhi)療(liao)效(xiao)果，作(zuo)者利(li)用(yong)銅(tong)綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌（P. aeruginosa）建立小鼠皮(pi)膚創面(mian)感(gan)染(ran)模(mo)型(xing)（圖5A）。將感染(ran)小鼠隨(sui)機分為(wei)8組（每(mei)組n = 5），包括非超(chao)聲組（Blank、S-MN、LF/S-MN、LFT/S-MN）和超(chao)聲處理(li)組（Blank+US、S-MN+US、LF/S-MN+US、LFT/S-MN+US）。超(chao)聲方(fang)案(an)包括3 MHz每日(ri)照射，0.97 W/cm2，50%占空(kong)比(bi)，30分(fen)鐘，連續(xu)3天(tian)。在治(zhi)療後第0、1、3、5和9天(tian)通(tong)過拍(pai)照監(jian)測傷口進展（圖5B）。第1天(tian)，LFT/S-MN+US組膿(nong)性滲出明顯(xian)減(jian)少(shao)，反映了(le)CDT和SDT的聯合(he)抗(kang)菌(jun)作用(yong)。相(xiang)比(bi)之(zhi)下(xia)，非(fei)超(chao)聲組表現(xian)出更廣泛的膿毒和炎(yan)癥(zheng)。第(di)3天(tian)，超(chao)聲給(gei)藥完(wan)成(cheng)後，收集傷口床樣本(ben)進(jin)行(xing)細(xi)菌(jun)培養(yang)，評估殘(can)余細菌負荷（圖5E）。平板(ban)計(ji)數顯(xian)示，LFT/S-MN+US組菌(jun)落形成(cheng)最少(shao)，表明其體(ti)內抗(kang)菌(jun)活(huo)性更強(qiang)（圖5F）。到(dao)第(di)9天(tian)，LFT/S-MN+US處理(li)的小鼠傷口愈(yu)合率(lv)很高，組織再(zai)生明顯（圖5C）。在整(zheng)個(ge)治療(liao)過程(cheng)中，體(ti)重(zhong)監(jian)測顯(xian)示(shi)各組之(zhi)間(jian)沒(mei)有(you)明顯(xian)的波動(dong)（圖5D），表明MN貼片具有(you)良好(hao)的全身(shen)生物(wu)相(xiang)容(rong)性(xing)。綜(zong)上(shang)所(suo)述(shu)，這(zhe)些(xie)結果表明，LFT/S-MN與超(chao)聲結合，可(ke)以(yi)有(you)效(xiao)地消(xiao)除(chu)細菌(jun)感染(ran)並顯(xian)著加(jia)速體(ti)內傷口愈(yu)合。

圖5. LFT/S-MN貼劑(ji)的體(ti)內抗(kang)菌(jun)效(xiao)果和傷口愈(yu)合性(xing)能。（A）銅綠(lv)假(jia)單胞(bao)菌感(gan)染小鼠傷口模(mo)型(xing)的示意(yi)圖和使(shi)用(yong)MN貼(tie)片(pian)加(jia)或(huo)不加(jia)US刺激的治療(liao)策(ce)略。（B）處理(li)後第0、1、3、5和9天(tian)傷口部位的代表性照片。黑(hei)色虛(xu)線圈(quan)表示初始傷口邊(bian)界(jie)。（C）各治療(liao)組傷口愈(yu)合隨(sui)時(shi)間的定量(liang)分(fen)析(xi)（n = 5）。（D）治(zhi)療期間小鼠體(ti)重(zhong)監(jian)測（n = 5）。（E）各組第(di)3天傷口床培養(yang)細菌(jun)菌(jun)落的瓊脂板(ban)照片。（F）基於菌落形成(cheng)單位（CFU）分析(xi)的細菌(jun)活(huo)力(li)量(liang)化（n = 3）。數據(ju)以(yi)mean ± SD表示。*** p < 0.001，**** p < 0.0001。ns表示無(wu)顯著(zhu)性(xing)。

結論(lun)：此研(yan)究(jiu)成(cheng)功開(kai)發了(le)壹(yi)種(zhong)pH響應(ying)的雙(shuang)層微針貼片(pian)（LFT/S-MN），通(tong)過整(zheng)合超(chao)聲激(ji)活(huo)的協(xie)同抗(kang)菌(jun)療(liao)法（CDT/SDT）與(yu)酸性微環境(jing)觸發的免疫調(tiao)節(jie)，實(shi)現(xian)了(le)對(dui)感染傷口的高效(xiao)治療(liao)。該(gai)貼片(pian)不僅(jin)能(neng)快速釋(shi)放靶(ba)向(xiang)細(xi)菌(jun)的LFT NPs，在超(chao)聲下(xia)產(chan)生大(da)量(liang)ROS以(yi)清(qing)除(chu)細菌(jun)和生物(wu)膜，還能在傷口酸性條(tiao)件下持(chi)續(xu)釋(shi)放SPD，調(tiao)節(jie)巨噬細(xi)胞(bao)極化，抑(yi)制過度(du)炎癥(zheng)。體(ti)內實(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)，該(gai)策略能(neng)顯(xian)著加(jia)速傷口閉合，促(cu)進(jin)組織再(zai)生，且具有(you)優異的生物(wu)安(an)全性(xing)。該(gai)工作為(wei)非抗生素依賴的感染(ran)傷口治療與(yu)組織再(zai)生提供了(le)壹(yi)種(zhong)具有(you)臨床轉化潛力(li)的新策(ce)略。