新壹(yi)代CRISPR平(ping)臺，檢(jian)測時間縮短80%！

近(jin)期(qi)，香(xiang)港中文(wen)大(da)學(xue)（深圳）醫學院劉國珍教(jiao)授團(tuan)隊在(zai)CRISPR/Cas生(sheng)物(wu)傳(chuan)感技(ji)術(shu)用於(yu)精(jing)準(zhun)醫療(liao)方向(xiang)取得(de)重(zhong)要突(tu)破(po)，相(xiang)關研究成(cheng)果(guo)——“Glass fiber-interfaced CRISPR/Cas biosensing for diverse biomarker detection"研究論(lun)文(wen)發(fa)表(biao)於(yu)國際期(qi)刊Cell子(zi)刊Trends in Biotechnology。

研究團(tuan)隊(dui)成(cheng)功(gong)開(kai)發(fa)出(chu)壹款基於玻璃(li)光(guang)纖(xian)界面(mian)的(de)通用CRISPR/Cas檢(jian)測平(ping)臺（g-CURS），實現對低(di)豐(feng)度多(duo)種(zhong)待(dai)測物(wu)（核酸(suan)或(huo)蛋(dan)白質等(deng)）的(de)超高靈(ling)敏(min)識(shi)別與便攜式(shi)快(kuai)速(su)定(ding)量(liang)檢(jian)測，賦(fu)能精(jing)準(zhun)醫療(liao)與床旁(pang)檢(jian)測（POCT）。該(gai)g-CURS體系(xi)是劉(liu)教(jiao)授研究團(tuan)隊(dui)繼(ji)2024年在(zai)Cell子(zi)刊(kan)Device上(shang)報道(dao)的(de)CRISPR檢(jian)測平(ping)臺GUSCI體系(xi)的(de)技(ji)術(shu)升(sheng)級。g-CURS體系(xi)實現了在(zai)同(tong)壹(yi)平(ping)臺、用同(tong)壹(yi)試(shi)劑(ji)體系(xi)檢(jian)測多(duo)種(zhong)靶標(biao)核酸(suan)與(yu)靶標(biao)蛋(dan)白質，標誌(zhi)著CRISPR檢(jian)測技(ji)術從(cong)“單(dan)指(zhi)標專屬(shu)探(tan)針"限制躍升為“壹(yi)對通用試(shi)劑(ji)檢(jian)測多(duo)類(lei)靶標"的(de)標(biao)準(zhun)化操作流程(cheng)，大(da)大(da)降(jiang)低(di)研發(fa)與應(ying)用成(cheng)本(ben)，為CRISPR診(zhen)斷(duan)技(ji)術(shu)的(de)POCT化、規模化及(ji)商(shang)業化提(ti)供(gong)了新(xin)策(ce)略(lve)，可(ke)廣泛應(ying)用於(yu)病(bing)原體靈(ling)敏(min)檢(jian)測和(he)傳(chuan)染性疾(ji)病(bing)的(de)快(kuai)速(su)篩(shai)查、癌(ai)癥(zheng)及(ji)慢性病(bing)早(zao)期(qi)精準(zhun)診斷、指(zhi)導疾病精準(zhun)用藥(yao)、新藥(yao)開(kai)發(fa)的(de)藥(yao)效評估、醫美(mei)術後(hou)恢(hui)復監(jian)測，及(ji)動(dong)物健(jian)康(kang)檢(jian)測等(deng)。

技術研究背(bei)景(jing)

在(zai)傳(chuan)染性疾(ji)病(bing)監(jian)測、慢性病(bing)管理(li)和腫(zhong)瘤早篩(shai)、及(ji)精(jing)準(zhun)醫療(liao)等(deng)醫學場景(jing)中，體液(ye)中核酸(suan)與(yu)蛋(dan)白質等(deng)多(duo)種(zhong)生(sheng)物(wu)標(biao)誌(zhi)物的(de)高(gao)靈(ling)敏(min)檢(jian)測至(zhi)關重(zhong)要。然(ran)而，當(dang)前主流(liu)方法如qPCR、ELISA仍(reng)存在(zai)操作繁瑣(suo)、昂貴(gui)儀(yi)器(qi)依賴(lai)、樣本需(xu)求(qiu)量(liang)大(da)、檢(jian)測時間長(chang)、不(bu)適合(he)資源貧乏(fa)場景(jing)等(deng)臨(lin)床應(ying)用問(wen)題。

雖(sui)然(ran)CRISPR技(ji)術已逐(zhu)步(bu)應(ying)用於(yu)體外(wai)診斷(duan)，但(dan)傳(chuan)統策略(lve)需(xu)針對每(mei)種(zhong)靶點(dian)單獨(du)設計crRNA和(he)激(ji)活子，對於(yu)低(di)豐(feng)度待(dai)測物(wu)檢(jian)測還高度依賴(lai)核(he)酸(suan)預(yu)擴增(zeng)程(cheng)序，導致(zhi)前期(qi)設計篩(shai)選優化步(bu)驟復雜、檢(jian)測時間長(chang)、應(ying)用效率(lv)低(di)、通用性差。為(wei)此，劉(liu)教(jiao)授研究團(tuan)隊(dui)開(kai)發(fa)了壹(yi)種(zhong)無(wu)需(xu)預(yu)擴增(zeng)的(de)便攜式(shi)CRISPR/Cas快(kuai)速(su)檢(jian)測平(ping)臺：g-CURS，不僅(jin)解(jie)決了傳(chuan)統檢(jian)測方(fang)法在(zai)臨(lin)床應(ying)用的(de)難(nan)題，還拓展(zhan)了CRISPR/Cas生(sheng)物(wu)傳(chuan)感技(ji)術(shu)在(zai)精(jing)準(zhun)醫療(liao)的(de)應(ying)用，實現同(tong)壹(yi)體系(xi)多(duo)種(zhong)生(sheng)物(wu)標(biao)識物(wu)同(tong)時檢(jian)測。

g-CURS技(ji)術原理(li)和亮(liang)點

g-CURS檢(jian)測平(ping)臺利用玻(bo)璃(li)光(guang)纖(xian)作為載(zai)體，借(jie)助(zhu)CRISPR/Cas12a指(zhi)數信號(hao)放(fang)大(da)技術，利用同(tong)壹(yi)套crRNA和(he)ssDNA激活(huo)子試(shi)劑(ji)系(xi)統即可(ke)檢(jian)測不(bu)同(tong)核(he)酸(suan)和(he)多(duo)種(zhong)蛋(dan)白質靶標，無(wu)需(xu)針對不(bu)同(tong)靶(ba)標個性化設計相(xiang)應(ying)CRISPR RNA和對應(ying)的(de)靶(ba)標(biao)位點篩(shai)選；其中檢(jian)測平(ping)臺內的(de)芯(xin)片通道(dao)結(jie)構(gou)是由(you)摩方精(jing)密(mi)面(mian)投(tou)影微立體光(guang)刻（PμSL）技(ji)術(shu)（nanoArch^® S140，精度：10μm）制備模具後(hou)經(jing)PDMS翻(fan)模而成(cheng)；核酸(suan)識(shi)別環(huan)節(jie)采用T4 DNA連(lian)接酶(mei)，精(jing)準(zhun)鑒別單堿基差異。無(wu)需(xu)預(yu)擴增(zeng)，CRISPR/Cas利用AutoCAR級(ji)聯放(fang)大(da)原理(li)和CONAN反(fan)應(ying)網(wang)絡(luo)誘導信號(hao)指(zhi)數放(fang)大(da)循環，實現30分鐘(zhong)內快速等(deng)溫(wen)放(fang)大(da)；在(zai)玻(bo)璃(li)光(guang)纖(xian)表(biao)面(mian)構(gou)建(jian)捕(bu)獲(huo)抗(kang)體與(yu)標(biao)記有(you)ssDNA的(de)檢(jian)測抗(kang)體的(de)“免(mian)疫夾心結構(gou)"，實現蛋(dan)白質信號(hao)轉換(huan)和放(fang)大(da)；采用自制便攜式(shi)熒(ying)光(guang)儀(yi)讀取待(dai)測物(wu)信號(hao)，內(nei)置高分辨(bian)率定焦鏡頭和無(wu)線模塊(kuai)，搭配終端(duan)用戶(hu)手機App實現結果可(ke)視化與智能診斷，支持(chi)非(fei)專業人員獨(du)立操作，滿足POCT應(ying)用場景(jing)需(xu)求(qiu)。

臨(lin)床應(ying)用性能(neng)評估

g-CURS具備高(gao)效準(zhun)確的(de)臨(lin)床檢(jian)測性能(neng)，高(gao)特(te)異識別(bie)SARS-CoV-2 Delta突(tu)變(bian)體cDNA和(he)HPV16 E7基(ji)因片(pian)段，檢(jian)測時間約(yue)為30分鐘(zhong)；可(ke)精準(zhun)識別6個堿基以(yi)內(nei)的(de)突(tu)變(bian)差異，具備單(dan)堿基錯配分辨(bian)能力，在(zai)HPV16臨(lin)床樣本中，檢(jian)測結(jie)果與(yu)qPCR壹致(zhi)。應(ying)用於(yu)帕(pa)金(jin)森癥(zheng)患(huan)者血(xue)清樣本，g-CURS能(neng)實現高靈(ling)敏(min)檢(jian)測腦源外(wai)泌體膜內低(di)豐(feng)度炎(yan)癥蛋(dan)白（IL-6、TNF-α、IFN-γ等(deng)），支持(chi)低(di)樣本量(liang)的(de)多(duo)指(zhi)標共檢(jian)。與(yu)商用ELISA試(shi)劑(ji)盒相(xiang)比(bi)，檢(jian)測靈(ling)敏(min)度提(ti)高(gao)了2-3個數量(liang)級(ji)，檢(jian)測時間縮短了80%, 所(suo)需(xu)樣本體積(ji)極(ji)大(da)減(jian)少(shao)（僅(jin)需(xu)5μL），檢(jian)測成(cheng)本降(jiang)低(di)了90%，實現了便攜式(shi)CRISPR/Cas體外(wai)診斷(duan)技術多(duo)物(wu)質同(tong)時檢(jian)測。這(zhe)壹突(tu)破(po)性CRISPR/Cas檢(jian)測平(ping)臺有(you)望推(tui)動(dong)精準(zhun)醫療(liao)從(cong)實驗室走向社區(qu)，為(wei)疾病早期(qi)診斷(duan)和動(dong)態監(jian)測提(ti)供(gong)更(geng)便捷(jie)、更(geng)經(jing)濟的(de)解(jie)決方(fang)案(an)。

本論(lun)文(wen)作(zuo)者為(wei)香(xiang)港中文(wen)大(da)學(xue)（深圳）醫學院生(sheng)物(wu)科學(xue)專業博(bo)士(shi)研究生(sheng)余(yu)湉(tian)，論(lun)文(wen)通訊(xun)作者為(wei)香(xiang)港中文(wen)大(da)學(xue)（深圳）醫學院劉國珍教(jiao)授。該(gai)工作得(de)到了國(guo)家自然科學(xue)基(ji)金(jin)、廣(guang)東(dong)省基礎(chu)與應(ying)用基(ji)礎(chu)研究基(ji)金(jin)企(qi)業聯合(he)基金(jin)、廣(guang)東(dong)省“珠(zhu)江人才(cai)計劃"、深圳灣實驗室開(kai)放(fang)基(ji)金(jin)、港(gang)中深-博(bo)雅(ya)生(sheng)命(ming)聯合(he)實驗室基金(jin)以(yi)及(ji)大(da)學發(fa)展基金(jin)等(deng)的(de)資助(zhu)。